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        什么是RT-PCR

        发布时间:2014-3-14 10:09:31??????浏览次数:

        逆转录PCR

        RT-PCR即逆转录PCR。

        RT-PCR 为反转录PCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real time PCR)共同的缩写。逆转录PCR,或者?#21697;?#36716;录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶?#35789;?#21453;应(PCR)的一种广?#27827;?#29992;的变形。在RT-PCR中,一条RNA?#24162;?#36870;转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

        1mode逆转录PCR

        由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录?#20445;?#30001;?#35272;礡NA的DNA聚合?#31119;?#36870;转录?#31119;?#26469;完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和?#35272;礑NA的DNA聚合酶完成,随每个循?#32321;对觶?#21363;通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下互补DNA。

        RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷?#35789;?#30340;RNA。RT-PCR广?#27827;?#29992;于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。(检测基因表达的方法,参见Northern Blot法。

        RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录,要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白?#23454;?#26434;?#30465;?#24120;用的反转录酶有两种,即鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MMLV)反转录酶。

        RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别,通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

        2实时PCR

        实时PCR(real-time PCR),属于定量PCR(Q-PCR)的一种,以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量?#27835;觥?/span>

        real time PCR 的定量使用荧光色素,目前有二?#22336;?#27861;。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素,例如SYBR Green荧光染料;另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结?#31995;?#19968;种荧光探针(probe),如Taqman探针。两?#22336;?#27861;原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光,当反应体系中存在双链DNA时,SYBR Green与双链DNA结合,此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信?#30111;?#28140;灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测?#20581;?/span>

        real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合,能用微量的RNA来?#39029;?#29305;定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)”

        3RT-PCR技术相关试剂

        oligo: 多聚体,相当于mRNA引物

        AMV RT:禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶

        MMLV RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶

        dNTPs?#21644;?#27687;核苷酸

        RNase:RNA水解酶

        PCR Buffer:RT-PCR缓冲液

        MgCl2:2价镁离子


        PCR各步骤的目的

        预变性

        破坏DNA中可能存在的较难破?#26723;?#20108;级结构。使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活Taq?#31119;?#20174;而使PCR反应得?#36816;?#21033;进行。

        三种循环

        ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下?#22336;?#24212;作准?#31119;?/span>

        ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

        ③引物的?#30001;歟篋NA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,?#34892;?#21015;为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

        ?#30001;?#26102;间原因

        用PCR仪扩增时,(变性.退火,?#30001;?循环完成后,继续72度?#30001;?#20102;10?#31181;?#30340;原因:

        1.?#30001;?#26102;间取决于待扩增DNA片段的长?#21462;#?#24403;然是在反应体系一定的条件下)例如,使用TaqDNA聚合?#31119;?2度时的碱基掺入率为35-100bp/s,因?#25628;由?#36895;率为1kb/min。

        2.根据?#30001;?#36895;率推得,扩增1kb以内的DNA片段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,依次照推。通常在最后一轮要?#23454;?#30340;将?#30001;?#26102;间延长至4-10min,这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。

        3.继续72度?#30001;?#20102;10?#31181;?#38500;了可以使PCR反应完全以提高扩增产?#23458;猓?#36824;有一个作用是:在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用,可以直接用于TA克隆的进行。

        PCR引物的选择

        对?#34892;?#21015;中潜在的引物位点进行?#27835;觶?这些位点应该不会形成同源多聚体机构,也没有明显的形成二级结构的趋势,不会自身互补,与基因组中的其他序?#24418;?#26174;著的同源性。

        (1)依据寡核苷酸引物与其?#34892;蛄行?#25104;杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温?#21462;?/span>

        (2)选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似,将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。

        (3)对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3‘末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律,一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。

        注意事项

        (1)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的,C+G含量越高,模板DNA的溶解温?#26579;?#36234;高。在选择的变性温度下,模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短,会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温?#21462;?/span>

        (2) 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高,寡核苷酸引物不能与模板很好的复性,扩增效率将会?#26723;汀?#22914;果复性温度太低,引物将产生非特异性复性,从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行。

        (3)PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷?#35789;?#20197;及引物?#30001;?#21644;扩增的效?#30465;?#19968;旦PCR反应进入几何级数的增长期,反应会一直?#20013;?#19979;去,直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说,扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物,而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程?#21462;?#29992;TaqDNA聚合?#31119;?#25928;率为0.7)在一个含有10的5次方个拷贝的?#34892;?#21015;的反应体系中进行30个循?#27867;?#24448;往可以做到上述的理想情况。

         

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