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        什么是RT-PCR

        發布時間:2014-3-14 10:09:31??????瀏覽次數:

        逆轉錄PCR

        RT-PCR即逆轉錄PCR。

        RT-PCR 為反轉錄PCR(reverse transcription PCR)和實時PCR(real time PCR)共同的縮寫。逆轉錄PCR,或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

        1mode逆轉錄PCR

        由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉錄”,由依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉錄酶)來完成。隨后,DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成,隨每個循環倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下互補DNA。

        RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術,可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷,并且可以用于定量監測某種RNA的含量。(檢測基因表達的方法,參見Northern Blot法。

        RT-PCR的關鍵步驟是在RNA的反轉錄,要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質等雜質。常用的反轉錄酶有兩種,即鳥類成髓細胞性白細胞病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)反轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MMLV)反轉錄酶。

        RT-PCR有時候也會指代實時PCR(real-time PCR)。為了與逆轉錄PCR相區別,通常被寫作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

        2實時PCR

        實時PCR(real-time PCR),屬于定量PCR(Q-PCR)的一種,以一定時間內DNA的增幅量為基礎進行DNA的定量分析。

        real time PCR 的定量使用熒光色素,目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素,例如SYBR Green熒光染料;另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的一種熒光探針(probe),如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時不發光,當反應體系中存在雙鏈DNA時,SYBR Green與雙鏈DNA結合,此時才發光。Taqman探針帶有一個熒光基團和一個淬滅基團,熒光基團連接在探針的5’末端,而淬滅基團則在3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,此時熒光基團發出的熒光信號可以被檢測到。

        real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結合,能用微量的RNA來找出特定時間、細胞、組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)”

        3RT-PCR技術相關試劑

        oligo: 多聚體,相當于mRNA引物

        AMV RT:禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶

        MMLV RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶

        dNTPs:脫氧核苷酸

        RNase:RNA水解酶

        PCR Buffer:RT-PCR緩沖液

        MgCl2:2價鎂離子


        PCR各步驟的目的

        預變性

        破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構。使DNA充分變性,減少DNA 復雜結構對擴增的影響,以利于引物更好的和模板結合,特別是對于基因組來源的DNA模板,最好不要吝嗇這個步驟。此外,在一些使用熱啟動Taq酶的反應中,還可激活Taq酶,從而使PCR反應得以順利進行。

        三種循環

        ①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;

        ②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

        ③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

        延伸時間原因

        用PCR儀擴增時,(變性.退火,延伸)循環完成后,繼續72度延伸了10分鐘的原因:

        1.延伸時間取決于待擴增DNA片段的長度。(當然是在反應體系一定的條件下)例如,使用TaqDNA聚合酶,72度時的堿基摻入率為35-100bp/s,因此延伸速率為1kb/min。

        2.根據延伸速率推得,擴增1kb以內的DNA片段1min即可,而3-4kb則需要3-4min,依次照推。通常在最后一輪要適當的將延伸時間延長至4-10min,這樣做是使PCR反應完全以提高擴增產量。

        3.繼續72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應完全以提高擴增產量外,還有一個作用是:在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用,可以直接用于TA克隆的進行。

        PCR引物的選擇

        對靶序列中潛在的引物位點進行分析, 這些位點應該不會形成同源多聚體機構,也沒有明顯的形成二級結構的趨勢,不會自身互補,與基因組中的其他序列無顯著的同源性。

        (1)依據寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公式計算各引物的熔解溫度。

        (2)選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似,將產生一種大小和堿基組成合適的產物。兩條引物與所擴增片段的GC含量都應在40%-60%之間。

        (3)對寡核苷酸的長度和/或位置進行細調。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無明顯的互補性。作為一條經驗性的規律,一條引物上不該含有三個連續的與另一條引物互補的核苷酸。

        注意事項

        (1)雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的,C+G含量越高,模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下,模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短,會使僅僅富含A+T區域變性。當模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。

        (2) 復性過程采用的溫度至關重要如果復性溫度太高,寡核苷酸引物不能與模板很好的復性,擴增效率將會降低。如果復性溫度太低,引物將產生非特異性復性,從而導致非特異性的DNA片段的擴增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進行。

        (3)PCR擴增所需的循環數目決定于反應體系中起始的模板拷貝數以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進入幾何級數的增長期,反應會一直持續下去,直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說,擴增產物中絕大多數應該是特異性的擴增產物,而非特異性的擴增產物應該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶(效率為0.7)在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應體系中進行30個循環后往往可以做到上述的理想情況。

         

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