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        哪种方法检测瘦肉精较精准?

        发布时间:2017-4-17 12:52:57??????浏?#26469;?#25968;:
        瘦肉精检测高效液相色谱法(盐酸克伦特罗检测方法)
        液相色谱仪

        一、如何检测瘦肉精

            目前,检测瘦肉精的方法主要有四种,即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-?#21183;?#27861;(GC-MS)、毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析技术(IA)。而我国结?#29486;?#24049;的实际情况,2001年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择?#33539;?#20102;两种:即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-?#21183;?#27861;(GC-MS)。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法,其最低检测限为0.05μg/ kg,?#35834;?#26159;检测精?#33539;?#39640;,而且假阳性?#23454;停?#32570;点是检测过程烦琐、检测时间长,需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。而GC-MS法?#35834;?#26159;能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。GC-MS法与HPLC法相比,检测灵敏度更高,假阳性率更低,已将GC-MS法定为检测瘦肉精的确证性方法。GC-MS法的缺点同HPLC相似。

            目前,英国的Randox Laboratories litd和德国的R-biopharm公司均开发出了检测肉品、饲料中瘦肉精的ELISA试剂盒。

        二、瘦肉精检测所需试剂和试纸

          (1)试剂和材料  以下所有试剂,除特别注明外,均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的二级水。
            ①盐酸克伦特罗对照品:含盐酸克伦特罗不得少于98.5%
            ②盐酸
            ③无水甲醇
            ④氢氧化钠
            ⑤磷酸二氢钾
            ⑥磷酸
            ⑦盐酸溶液  取盐酸4.2ml,加水至1000ml,即得。
            ⑧o.5mol/L磷酸二氢钾溶液  取磷酸二氢钾68g,加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3.O,用水稀释至1000ml,即得。
            ⑨0.05mol几磷酸二氢钾溶液  取磷酸二氢钾6.88,加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3.0,用水稀释至1000mi,即得。
            a.氢氧化钠溶液  取氢氧化钠48,加水使溶解成100mi,即得。
            b.盐酸克伦特罗对照品储备液(1mg/mi)  准确称取28.3mg盐酸克伦特罗对?#31449;?#33267;25ml?#31185;?#20013;,用甲醇溶解并稀释至25ml,一20~C以下保存,有效期1年。
            ⑩盐酸克伦特罗对照品工作液(10ttg/mi)  取lmg/mi储备液o.5ml到50mi?#31185;?#20013;,加水至50mi,2~8~C保存,有效期1个月。
            ⑾盐酸克伦特罗对照溶液(100ng/m1)  取1(ug/m1工作液o.5ml到:50mi?#31185;?#20013;水至50mi,2~8~C保存,有效期1个月。
            ⑿盐酸克伦特罗检测试剂盒(2~8~C冰箱中保存)
            ⒀固相萃取柱C,s:100mglml含?#21058;俊?7%

            (2)仪器和设备

        STI500高效液相色谱仪

        VI2010智能色谱软件

        UV501可变光紫外检测器

        安捷伦1100二极管阵列检测器

        8725i手动进样阀、VI-11手动进样阀

        VertexC18 4.6*250,5um高性能液相色谱柱
            ①酶联免疫反应读数仪
            ②分析天平  精度0.00001g
            ③天平  精度0.01g
            ④冷冻离心机
            ⑤50mi具塞离心管
            ⑥匀浆机
            ⑦微型振荡器
            ⑧回旋振荡器
            ⑨微量移液器  单道20uL,50ul,100uL;多道50~250uL,
            ⑩干热浓缩器
            ①空气压缩机

            (3)测定步骤
            ①试?#31995;?#21046;备(尿)
            取供试尿lml,于3000r/min离心l0min,上清液作为供试试料,直接供酶联免疫测定法测定。
            取空白尿lml,于3000r/min离心l0min,上清液作为空?#36164;?#26009;,直接供酶联免疫测定法测定。
            取空白尿2ml,于3000r/min离心l0min,上清液1.0ml添加l00ug/L的克伦特罗对照溶液20/H。作为2ug/l空白添加试料,直接供酶联免疫测定法测定。
            ②试?#31995;?#21046;备(肝)
            取约l00g新鲜或冷冻后融化的空白或供试猪肝,用匀浆机以10000r/rain匀浆1-2min,使均匀呈糊状,一20~C以下冰箱中贮存备用。
            取均浆后的供试肝样,作为供试试料。
            取均浆后的空白肝样,作为空?#36164;?#26009;。
            取均浆后的空白肝样(1土0.05)e添加l00ng/m1的克伦特罗对照溶液20tzL作为2ng/g空白添加试料。
            a:提取(肝)  取(1士o.05)z试料,置50ml离心管中;加盐酸溶液5.0mi,旋涡混匀,中速振荡1.5h;在10—15~C下以4000r/mill以上速度离心15min;上清液移人另一50ml离心管中,加入氢氧化钠溶液300gL,混匀,振荡15min;加0.5mol/l磷酸二氢钾溶液4。0ml,混匀,2—8~C放置过夜;取上述溶液于10~15~C以4000r/111113以?#31995;?#36895;度离心15min,上清液备用。
            b.净化(肝)  C,,固相萃取柱?#26469;?#29992;无水甲醇3mi、0.05mol/L磷酸二氢钾溶液2mi预洗,不使柱床干涸;将备用上清液全部过柱;用0.05mol/L磷酸二氢钾溶液2ml淋洗,挤干,弃去所有淋洗液;用无水甲醇2mi洗脱,流速控制在0.5ml/mm以下,挤干,收集洗脱液;于50~60~C下用氮气或空气缓缓吹干洗脱液;残余物用水1.0ml溶解,以4000r/mill以?#31995;?#36895;度离心15rain,清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定。
            ③测定
            a.室温应控制在19~30~C。
            b.取在19—30~C放置1—2h的试剂盒,按每个标准溶液和试样溶液至少两?#20934;?#31639;所需酶联板条的数量,插入框架。每个微?#20934;?#20837;用缓冲溶液100?#26029;?#37322;的抗体100~tL,封口膜封板,室?#36335;?#32946;30min。
            c倒出孔内液体,将酶联板倒置在吸水纸上拍打,使孔内没有残余液体。用多道移液器加水250pL到酶联板的微?L内,稍后倒出孔内液体,再将酶联板倒置在吸水纸上拍打,如此重复操作洗板3次。
            d.分别吸取标准溶液、空?#36164;?#26009;、空白添加试料和供试试?#32454;?0uL,分别放入不同微孔底中央,并在每孔内加入用缓冲溶液100?#26029;?#37322;的酶结合物100~I。,在微型振荡器上混匀,用封口膜封好,室?#36335;?#32946;30min。
            e.倒出孔内液体,将酶联板倒置在吸水纸上拍打,使孔内没有残余液体,重复洗板3次。
            f.用多道移液器加入用底物缓冲溶液10?#26029;?#37322;的底物100uL,室温避光孵育15min。
            g.用多道移液器每?#20934;?#32456;止液100uL。
            h.在1h内将酶联板放于酶标仪内,于450nm波长处测定吸光度值。

        http://syltech.b2b.hc360.com/

            (4)计算  用数据分析软件对结果进行分析,绘出标准曲线,并得出试料中克伦特罗的含量。

            (5)灵敏度和回收率
            本方法的平均检测下限为0.1mg/Kg。

            本方法在1ug/kg添?#20248;ǘ人?#24179;?#29616;?#23615;回收率范围为60%一120%,猪?#20301;?#25910;率范围为40%~120%。

        【公司名称】 广州健仑生物科技有限公司
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