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        口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒说明书

        发布时间:2017-4-12 14:45:00??????浏?#26469;?#25968;:


        一 、试剂盒内含物

        .说明书亚洲 1 型口疫阳性对照血清己稀释浓度为 1:8)

        .96  ELISA 亚洲 1 型口蹄疫阴对照血清

        .液体稀释槽3% 氧水

        .U 96孔抗原抗体反应板25×PBST洗涤液(稀释时准确量取)

        .封板膜豚鼠抗血清稀释液

        .灭活亚洲型口蹄疾病毒抗 (决包裹 )终止液

        .亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被缓冲液(碳酸盐)胶囊

        .亚洲口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲片剂

        .兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物OPD片剂

        二、器材准备 ( 需用户自备 )

         1.移液器:5-50μl移液器、0.210μl移液器、50200μl移液器、50300μ12道移液器各一?#36873;?/span>

         2.移液枪 (若干)

         3.抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗抗体反应。注:抗原抗体反应板可重?#35789;?#29992;,实验后,用水冲洗干净,?#32531;?#29992;无离子水沸水浴30,晾干,待用。

         4.纯水 , 无离子水或蒸馏水。

        试剂准备(需用户完成)

        1.包被缓冲液(PH9.6)

           将本试剂配备的碳酸?#20301;?#20914;液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4存放,1月内有效。

        2. 洗涤液(PBST)

           将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST (可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸水做1:25稀释。(如果PH?#26723;?/span>,务必用NaOH调至7.4)

        3.底物溶液

          取1柠檬酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,50mL溶液再加1片邻苯二(OPD)片剂,充分溶解,分装5mL/ 瓶或 10Ml ), 避光之-2O℃保存。?#20204;?/span>光溶化 ,时每1mL上述溶液加 10μL本试剂配备的 3% 双氧(H202务必加双氧水!

        操作步骤

         1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000),  ELISA 板上每孔加 50μl振荡 , 封板或湿室温过夜。

        2. 抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应

        根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作

        196 孔酶标板检测 10 份样品布局图


        S1 1:8

        S2

        S3

        S4

        S5

        S6

        S7

        S8

        S9

        S10

        +1:32

        -1:4

        1:16

        164

        1:8

        1:32

        1128

        1:64

        1256

        1:128

        1512

        1:256

        1:1024

        1:512

        1:2048

        1:l024

        1:4096


        为抗体滴度测定 (定量检测 10 份样品布局图; 2 为抗体滴度测定定量 )检测 20 份样品布局图。

        296 孔酶标板检测 20 份样品布局图


        S11:32

        S2

        S3

        S4

        S5

        S6

        S7

        S8

        S9

        S10

        +1:32

        -1:4

        1:64

        1:64

        1:8

        1:128

        1:128

        1:256

        1:256

        S111:32

        S12

        S13

        S14

        S15

        S16

        S17

        S18

        S19

        S20

        1:512

        1:64

        1:1024

        1:128

        1:2048

        1:256

        1:4096


        以图为例 ,  U 型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳对照血清 , ?#32531;?#27599;加入 50 μl PBST 稀释到使用浓度的亚洲型口疫病毒抗原 (1:4,1份病毒抗、加3PBST), 病毒抗对照孔加100μl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2?#26029;?#37322;。

        3.用洗涤液 (1×PBST)  ELISA,在洗水纸上甩干,再将抗抗体混合物从抗抗体反应板上?#21019;?#24207;转移至ELISA板?#31995;?#30456;对应孔,每孔50μl封板,37温育1小时。

        4.同上洗5甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 孔加50μl,封板,37温育1小时。

        5.同上洗 5  , 甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 孔加 50 μl封板 ,37 温育 1 小时。

        6. 同上洗板5,孔加50μl底物溶液 (务必加双氧水),37温育15分钟。每孔再加50μl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm)

        五、结果判定

        1. 试验认可标准

        每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,?#33519;?#29992;PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50μl/,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.5±0.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应<1:8

        2.病毒抗原对照平均OD492nm 50%计算(临界值)

        抗原对照是4,弃去最高和最低OD492nm,计算剩余2孔的平均OD492nm,再除以2,50%对照值。该值?#27425;?#20020;界值,表示阻断50%反应的对照OD492nm值。

        3.结果判定

        以病毒抗原对照平均OD492nm ?#26723;?/span>50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm?#33633;?#20110;临界?#26723;?#23380;为阴性孔,小于或等于临界?#26723;?#23380;为阳性孔,阳性孔的OD492nm?#26723;?#20110;临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%0.60。若某一待检血清在1:128OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界?#33633;?#20110;两个滴度之间 ,如处于1641128之间,则抗体滴?#28909;?#20013;间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度>1:128 

        ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。

        ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护;效价≤1:16, 不保护;效价在1:22-90之间,50%保护。


        猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书

        一、原理

        用己知血凝抗原检测未知血清抗体的试验,称为正向间接血凝试验,亦称间接血凝。抗原与其对应的抗体相遇,在一定条件下形成抗原——抗体复合物。但这种复合物的分子团很小人肉眼看不见。将抗原吸附(?#26053;?/span>)在红细胞表面,制成猪瘟血凝抗原,用于检测免疫动物血清中的猪瘟抗体水?#20581;?/span>

        这种经过猪瘟抗原?#26053;?#30340;红细胞与猪瘟抗体相遇,红细胞便出现清晰的凝集现象。

        二、适用范围

        主要用于检测猪瘟免疫抗体效价,以便制定正确的免疫程序,保?#29616;?#32676;免遭猪瘟强毒的感染。

        三、试验器材,

        196110V型医用血凝板,与血凝板大小相同的玻板。

        21微量移液器(50微升、25微升)取液塑料咀。

        3、微量振荡器。

        4猪瘟血凝抗原

        5猪瘟阴性对照、血清。

        6猪瘟阳性对照血清。

        7、稀释液。

        8、待检血清(?#23458;?#32422;0.5ml血清即可)。

        四、试验方法

        1、加稀释液

        在血凝板上16排的19孔;第7排的14孔第6孔;第8排的112孔各加稀释液50微升。

        2、稀释待检血清

        1号待检血清50微升加入第1?#35834;?/span>l孔,并将塑咀插入孔底,右手拇指指轻压弹簧12?#20301;?#21248;(避免产生过多的气泡),从该孔取出50微升移入第2孔,混匀后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第114孔待检血清的稀释度(稀释倍数)?#26469;?#20026;:1:21)、1:4(2)1:8(3)1:16(4)1:32(5)1:646)1:128(7)1:256(8)1:512(9)

        2号待检血清加入第2:3号待检血清加入第3排……均按上法稀释,注意!每取1份血清时,必须更换塑咀一个。

        3、稀释阴性对照血清

        在血疑板?#31995;?#31532;7?#35834;?/span>1孔加阴性血清50微升,对?#26029;?#37322;至第4孔,混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清的稀释倍数?#26469;?#20026;1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6孔为稀释液对照。

        4、稀释阳性对照、血清

        在血凝板?#31995;?#31532;8?#35834;?/span>1孔加阳性血清50微升,对?#26029;?#37322;至第12孔,混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阳性血清稀释倍数?#26469;?#20026;1:21:4096

        5、加血凝抗原

        被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血请各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原(充分摇匀,瓶底应无血球沉淀)25微升。

        6、振荡混匀

        将血凝板置于微量振荡器上振荡12分钟,如无振荡器;用手轻轻摇匀亦可。?#32531;?#23558;血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀,不出现血球沉淀为合格。盖上玻板,室温下或37下静置1.52小时判定结果,也可延至翌日判定。

        7、判定标准

        移去玻板,将血凝板放在白纸上,先观察阴性对照血清1:16孔,稀释液对照孔,均应无凝集(血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点),或仅出现凝集(血球大部沉于孔底,边缘稍有少量血球悬浮)

        阳性血清对照、1:21:256各孔应出现“++++++”凝集为合格,(少量血球沉入孔底,大部血球悬浮于孔内)

        在对照孔合格的前提下,再观察待检血清各孔,以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清15孔呈现“++++++”凝集,67孔呈现“++”凝集,第8孔呈现“+”凝集,第9孔无凝集,那么就可判定该份血清的猪瘟抗体效价为1:128

        接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价达到1:16(即第4)呈现“++”凝集为免疫合格。

        五、检测试剂性能要求

        1、性状

        (l)液体血凝抗原:摇匀?#39318;?#32418;色(或咖啡色),静置后,血球逐渐沉入瓶底。

        (2)阴性对照血清:淡黄色清亮稍带粘性的液体。

        (3)阳性对照血清:微红或淡黄色稍混浊带粘性的液体。

        (4)稀释液:淡黄或无色透明液体,低温下放置,瓶底易析出少量结晶,在水浴中加温后即可全溶,不影响使用。

        2、包装

        ()液体血凝抗原:摇匀后即可使用,5ml/瓶,?#31185;?#26816;测3040头份血清。

        (2)阴性血清:2ml/瓶,?#33519;?#31232;释使用。

        (3)稀释液:100ml/瓶,?#33519;邮?#29992;4保存。

        3、保存条件及保存期

        (l)液体血凝抗原:4保存(?#24418;?#20923;结),保存期4个月。

        (2)阴性对照血清:-15-20保存,有效期2年,4保存有效期半年。

        (3)阳性对照血清:-15-20保存,有效期2年,4保存有效期半年。

        六、注意事项

        1、为使您的检测获得正确结果请您在检测前仔细阅读本说明书。

        2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测以免发生非特异性反应。

        3、勿用90130血凝板以免误判结果。

        4、本法可单独检测猪瘟抗体水平也可同步检测口蹄疫免疫抗体水?#20581;?/span>

        5、用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2甩干水份放37恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒37干燥备用。

        6、每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。、

        -”表示完全不凝集或010%血球凝集;

        +”表示10-25%血球凝集;+++”表示75%血球凝集;

        "++"表示50%血球凝集;++++”表示90100%血球凝集


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